Un sistema CRISPR-CasΦ

Un sistema CRISPR-CasΦ hipercompacto en megafagos gigantes
Por Francisco R. Villatoro, el 18 julio, 2020. Categoría(s): Biología • Ciencia • Nature • Noticias • Science ✎

Sin duda debe ser muy importante este trabajo. Pero la mente de muchos de nosotros aun no esta preparada para entenderlo con suficiente claridad
No obstante tienen los autores mi admiración y sobre todo aquellos biólogos que contribuyeron a su descubrmiento.
El paso del tiempo y el esfuero, lo hará mas entendible y útil. Mientras tanto me limito a copiarlos
LOS FAGOS (virus que infectan bacterias) suelen tener un genoma de decenas de kilobases; los megafagos tienen genomas de cientos de kilobases (kb). En febrero de 2020, Jennifer A. Doudna y varios colegas publicaron en Nature el descubrimiento metagenómico de los «megafagos gigantes» (huge phages), con más 500 kb (el récord son 735 kb); lo más sorprendente era que tenían nuevos sistemas CRISPR-Cas. Ahora publican en Science que uno de ellos es un sistema CRISPR-Cas hipercompacto. Usa pequeñas proteínas CasΦ (como CasΦ1, CasΦ2 y CasΦ3) de entre 700 y 800 aminoácidos, en lugar de proteínas Cas como Cas9 y Cas12 que tienen entre 1000 y 1500 aminoácidos. Además, el sistema CRISPR-CasΦ está codificado en el ADN del megafago de forma hipercompacta, sin los genes de las proteínas Cas necesarias para agregar nuevas repeticiones a las secuencias CRISPR que se encuentran entre ellas y el gen de la proteína Cas (por contra, en bacterias entre la proteína Cas9 y las secuencias CRISPR se encuentran las tres proteínas Cas1, Cas2 y Csn2).
Doudna es famosa por ser uno de los pioneros que propuso el uso de los sistemas CRISPR-Cas en la edición génica. Por ello, en su artículo propone el uso del sistema hipercompacto CRISPR-CasΦ en la edición génica de plantas, animales y humanos. Por desgracia, no se sabe si la nucleasa CasΦ será tan específica como Cas9 o Cas12, lo que penalizaría su uso biotecnológico. El uso de la metagenómica para desvelar el sistema CRISPR-CasΦ, sin que se haya secuenciado ningún megafago, requiere demostrar que se transcribe y que es funcional; para ello se ha insertado mediante plásmidos en el genoma de una bacteria E. coli. Además, usando ribonucleoproteínas se ha vehiculado una CasΦ-2 para editar el gen PDS3 en un protoplasto de Arabidopsis thaliana. Un gran éxito, pero que nos recuerda que aún queda mucho trabajo de investigación en el sistema CRISPR-CasΦ para convertirlo en una herramienta útil en edición génica.
El nuevo artículo es Patrick Pausch, Basem Al-Shayeb, …, Jennifer A. Doudna, «CRISPR-CasΦ from huge phages is a hypercompact genome editor,» Science 369: 333-337 (17 Jul 2020), doi: https://doi.org/10.1126/science.abb1400; los megafagos gigantes se descubrieron mediante metagenómica en Basem Al-Shayeb, Rohan Sachdeva, …, Jillian F. Banfield, «Clades of huge phages from across Earth’s ecosystems,» Nature 578: 425-431 (12 Feb 2020), doi: https://doi.org/10.1038/s41586-020-2007-4, bioRxiv preprint 572362 (11 Mar 2019), doi: https://doi.org/10.1101/572362. Más información divulgativa en Sergio Ferrer, «Una nueva herramienta CRISPR ultracompacta revela el primer virus con antivirus», Agencia SINC (16 Jul 2020); me ha gustado como acaba su pieza: «un virus ‘imaginario’ robó un arma a una bacteria para enfrentarse a otros virus y, ahora, podría servirnos como herramienta de edición genética y diagnóstico».

Los megafagos que se descubrieron por metagenómica, la secuenciación masiva de muestras del entorno de fuentes muy variadas (suelo, aguas, heces, etc.). Se reconstruyeron nuevos genes que codifican sistemas CRISPR-Cas, ARN de transferencia (ARNt), sintetasas de ARNt, proteínas ribosómicas, y factores de transcripción, entre otros, que aún no estaban descritos. A partir del ARN ribosómico se reconstruyó su filogenia y se identificaron los principales clados a los que pertenecían. Gracias a ello se pudo inferir la existencia de 351 secuencias de fagos, 6 secuencias de plásmidos y 4 secuencias desconocidas. Las secuencias de fagos permitieron reconstruir cuatro genomas completos con longitudes de 634, 636, 642 y 735 kb; así se introduce el nuevo clado de los megafagos gigantes (huge phages).
Los fagos o bacteriófagos son virus que infectan a bacterias. En dicho proceso ocurren transferencias horizontales de genes que enriquecen el ADN del fago con ADN bacteriano; así se cree que es cómo han adquirido sistemas CRISPR-Cas novedosos. Estos sistemas les permiten competir con éxito con otros fagos que infecten a la misma bacteria; así las nucleasas Cas del fago cortan el ADN de la competencia. Y, además, también podrían ayudar a defenderse de los sistemas CRISPR-Cas que usa la propia bacteria para defenderse de ellos. Como no se ha logrado aislar ningún megafago y tampoco se ha intentado sintetizar ninguno a partir de su genoma reconstruido, se ignoran muchos de los detalles biológicos de estos megafagos. Como ocurre con los megavirus, los megafagos nos plantean la eterna cuestión si estos organismos parásitos celulares se pueden considerar seres vivos o no; en mi opinión, la cuestión es similar al problema del huevo y la gallina; la solución salomónica que suelo proponer es que si algo es estudiado por los biólogos, en lugar de por los químicos y los geólogos, entonces es algo «vivo».

Se han identificado tres ortólogos CasΦ divergentes en los datos metagenómicos, denominados CasΦ-1, CasΦ-2 y CasΦ-3. Los estudios de edición génica in vitro en E. coli han mostrado que CasΦ-2 y CasΦ-3 son más activas que CasΦ-1. Esta figura ilustra los lugares de corte del ADN monocatenario (ssDNA) para cada una de ellas (asociados a los dominios de escisión RuvC, también llamados pliegues RuvC); por cierto, se ha probado que no cortan ARN monocatenario (ssRNA ni cis, ni trans). Los interesados en más detalles deberían consultar el artículo en Science.

El nuevo sistemas CRISPR-CasΦ hipercompacto usa una sola nucleasa con un tamaño de entre 70 y 80 kilodalton, una proteína CasΦ (Cas12j) de la familia de proteínas Cas codificadas por el clado llamado Biggiephage; el sistema CRISPR-Cas usual de las bacteria procariotas usa tres o cuatro proteínas Cas, alcanzando la de mayor tamaño hasta ~160 kilodalton. Las nuevas CasΦ tienen la mitad de peso molecular que las Cas9 y Cas12a que se suelen usar en edición génica; ello permite soñar con sistemas de edición más compactos que pueden ser vehiculados de forma más sencilla (sobre todo para terapias in vivo en humanos).
En resumen, versatilidad y capacidad de programación de los sistemas CRISPR-CasΦ debe ser estudiada en detalle en el futuro. En los estudios in vitro, la edición génica con CasΦ-2 con una guía de ARN fue capaz de editar hasta el 33 % de las células, un valor comparable con los que se obtenían en los primeros estudios con CRISPR-Cas9, CRISPR-Cas12a y CRISPR-CasX. Sin embargo, no debemos tener falsas esperanzas, ya que el pequeño tamaño de las CasΦ es una ventaja clara, pero podría implicar una penalización en su especificidad en terapia génica. Quizás haya muchos otros sistemas CRISPR-Cas por descubrir en estudios metagenómicos. Sin lugar a dudas el campo de la edición génica está produciendo avances espectaculares de forma continuada.