LOS INFLAMASOMAS

¿Qué es la inflamación?

La inflamación es una respuesta del sistema inmune a un daño en el organismo. El daño puede ser causado por agentes de distinta naturaleza, por ejemplo mecánico (como puede ser un golpe o una fractura), infeccioso (por alguna bacteria o virus), químico (por contacto con alguna sustancia agresiva), etc.

El sistema inmune pone en marcha una serie de procesos necesarios para detectar, aislar y eliminar ese agente dañino. Posteriormente se iniciarán mecanismos de recuperación del tejido dañado. Estos procesos dan lugar a la característica tétrada de Celso: calor, rubor, tumor y dolor.  Pero también y de manera dominanate. TRASTORNOS FUNCIONALES

Hay dos tipos de inflamacion

Aguda: de comienzo rápido y duración corta en la que predomina el exudado de fluido plasmático y la acumulación de linfocitos.

Crónica: que se produce cuando la inflamación aguda no se resuelve. Permanece en el tiempo, bien porque el patógeno no se pueda eliminar como el caso de infecciones latentes, por la persistencia de cuerpo extraño o porque se desarrolle un problema de autoinmunidad.

¿Cómo se convierte la inflamación en crónica?

En una situación de daño tisular se va produciendo un equilibrio entre infiltración celular, división, migración y muerte. En la inflamación aguda esa homeostasis evoluciona hacia la resolución y desaparición de la inflamación, sin embargo, en la inflamación crónica se produce una acumulación y activación persistente de células inmunes. En esta situación aumenta la secreción de citoquinas que prolonga la vida de los linfocitos y macrófagos dando lugar a la cronificación del proceso.

Pero desde los estudios que dignificaban a la inflamación, los estudios recientes, ven a esta como causante de la mayoría de las enfermedades degenerativas.

El trabajo de Andrew H. Miller 1 y Charles L. Raison 2 aclara parte de la alteraciones psiquiátricas en los procesos crónicos inflamatorios

La interferencia entre las vías inflamatorias y neurocircuitos en el cerebro puede conducir a respuestas conductuales, tales como evitación de la  alarma, que probablemente se ha proporcionado una ventaja evolutiva en sus interacciones con patógenos y depredadores a los seres humanos tempranos. Sin embargo, en épocas modernas, estas interacciones entre la inflamación y el cerebro parecen impulsar el desarrollo de la depresión y pueden contribuir a la no respuesta a los tratamientos antidepresivos actuales. Datos recientes han aclarado los mecanismos por los cuales los sistemas inmunitarios innatos y adaptativos interactúan con neurotransmisores y neurocircuitos para influir en el riesgo para la depresión. Aquí detallamos nuestra comprensión actual de estas vías y discutir el potencial terapéutico de dirigirse el sistema inmunológico para tratar la depresión

Los conocimientos parciales llevan al error .

Quizás mas valida sea la frase del mal estudiante, tras un examen

“cuando sabia todas las respuestas, me cambiaron todas las preguntas”

La inflamación es mas que todo lo anterior, y los mecanismos reparadores de la inflamación son cada vez mas complejos

Sabemos desde hace muchos  qué tiempo que la inflamación es un mecanismo de reparación . fue considerado siempre

Cuando nos parecía que conocíamos algo de la inflamación, aparecen múltiples trabajos de como se regula y cronifica la inflamación y la multiplicidad de metabolitos que intervienen

EL INFLAMASOMA es una estructura conformada por proteínas intracelulares implicadas en el inicio de la respuesta inflamatoria por estímulo intracelular..

El ensamblaje y la activación del inflamasoma es un proceso esencial en los mecanismos naturales de defensa inmune. El inflamasoma es una plataforma de multiproteínas citosólicas que permite la activación de las caspasas proinflamatorias, las cuales transforman el precursor de la interleukina-1beta (pro-IL-1beta) a la forma activa, lo que conduce a una poderosa respuesta inflamatoria.

Se ha demostrado que algunas patologías autoinmunes están provocadas por la proteína criopirina, producida por el gen CIAS1, y que pertenece a la familia de proteínas NOD-LRR, las cuales en principio, protegen a las células contra las infecciones microbiológicas.

El inflamasoma es un complejo multiproteico formado por la caspasa 1, PYCARD, una NALP y en ocasiones una caspasa 5 u 11. La composición exacta del inflamasoma depende del activador que inicia el ensamblaje del inflamasoma.  

Un inflamasoma representa un complejo de alto peso molecular que activa las caspasas inflamatorias y activa las citocinas de la familia IL-1. Se han descrito varios inflamasomas y hasta ahora estaban definidos por la proteína NLR que contienen: el inflamasoma NLRP1 (NALP1), el inflamasoma NLRP3 (NALP3) y el inflamasoma IPAF (NLRC4).

Curiosamente, el inflamasoma AIM2, descrito recientemente, no contiene ningún miembro de la familia NLR. Los Iiflammasomas pueden activarse a través de múltiples señales, incluyendo bacterias, toxinas de origen microbiano, xenobióticos, PAMPs y DAMPs. Se sugiere que los dominios LRR de NLRP3 median la autorepresión, probablemente a través de las chaperonas SGT1 y HSP90 que mantienen NLRP3 en un estado inactivo. Al detectar sus respectivos ligandos, NLRP1 o NLRP3 se oligomerizan a través del dominio NACHT, lo que conduce a la agrupación de PYD y al reclutamiento de la proteína adaptadora ASC (proteína tipo speck asociada a apoptosis) debido a interacciones homotípicas PYD-PYD. En el caso de AIM2, la oligomerización es probablemente mediada por la agrupación en múltiples sitios de unión dentro de dsDNA y no por un dominio de oligomerización central como NACHT.

Las caspasas inflamatorias se acercan lo que permite la autoactivación y la formación de la caspasa activa. En el caso de la procaspasa-1, se forma un tetrámero p10 / p20 después de la autoescisión. Además de la caspasa-1, NLRP1 también puede reclutar caspasa-5 para el complejo, pero el papel de la caspasa-5 todavía está en debate. Al contrario de NLRP1, NLRP3 y AIM2, IPAF no recluta una molécula adaptadora, sino que interactúa directamente con la procaspasa-1 a través de su dominio CARD (consulte la Figura a continuación). Sin embargo, dependiendo del estímulo de IPAF, la activación máxima de caspasa-1 en sentido descendente de IPAF puede requerir ASC o NAIP. El ensamblaje de los diferentes inflamasomas provoca una cascada downstream. Sin embargo, la caspasa-1 parece ser la caspasa inflamatoria dominante asociada con los inflamasomas. Todas las caspasas inflamatorias tienen un dominio CARD seguido de un dominio que contiene el residuo catalítico cisteína y se denominan caspasas inflamatorias porque sus sustratos principales son citoquinas (como pro-IL-1β, pro-IL-18 y eventualmente pro-IL-33) Que se escinden a su forma activa y secretada. Además, la activación del inflamasoma puede llevar a la muerte de la célula huésped en ciertos tipos de células, conocida como piroptosis. Se cree que la piroptosis es importante para restringir la replicación intracelular de patógenos invasivos.

Aunque los mecanismos que regulan la actividad del inflamasoma siguen siendo poco conocidos, se identificaron varias proteínas que pueden interferir con la activación del inflamasoma y el procesamiento de la caspasa inflamatoria dependiente del inflamado. En general, se pueden distinguir dos subtipos de reguladores del inflamasoma: los que contienen un dominio CARD y los que tienen un dominio PYD. Dichas proteínas abarcan no solo los reguladores del inflamasoma derivados del huésped, sino también diversos factores de virulencia bacteriana que inhiben la activación de caspasa-1 y las proteínas virales PYD.

Como la IL-1β y otras citoquinas son actores clave en la respuesta inflamatoria, es tentador especular que la IL-1β, las caspasas inflamatorias y los inflamasomas desempeñan un papel importante en varias enfermedades. De hecho, algunas enfermedades hereditarias o adquiridas en humanos se han relacionado con una elevada IL-1β, algunas de las cuales pueden tratarse con antagonistas contra la IL-1β o su receptor. Varias enfermedades, conocidas como síndromos periódicos asociados a la criopirina (CAPS), se han relacionado directamente con mutaciones de NLRP3. Además, la gota, una enfermedad autoinflamatoria caracterizada por una inflamación severa de las articulaciones, está asociada con la deposición de cristales de MSU en las articulaciones, entre otras características. Como la MSU es un potente agonista del inflamasoma NLRP3, se cree que la IL-1β regulada por el inflamasoma ejerce un papel patógeno en la gota. Además, la secreción de IL-1β por el inflamasoma NLRP3 se desencadena por un alto nivel de glucosa extracelular en las células b. La IL-1β elevada es un factor de riesgo para el desarrollo de Diabetes Mellitus Tipo 2 (T2DM) y contribuye a la resistencia a la insulina. Esto funciona como un sensor para el estrés metabólico, como en la forma de urato monosódico (MSU) o hiperglucemia, la NLRP3 Es probable que el inflamasoma contribuya a la patogénesis de la gota o la DMT2, respectivamente. Además, varios reguladores del inflamasoma tienen una relevancia significativa en las enfermedades. En pacientes con FMF (fiebre mediterránea familiar), se demostró que la pirina estaba mutada. Los niveles elevados de IL-1β en la enfermedad autoinflamatoria PAPA (artritis piógena, pioderma gangrenoso y acné) se asocian con mutaciones en PSTPIP1, una proteína que interactúa con la pirina. En conjunto, esto indica la importancia de los reguladores de pirina e inflamasoma en las enfermedades autoinflamatorias y puede permitir nuevos puntos de entrada para el tratamiento de la enfermedad.

Como la IL-1β y otras citoquinas son actores clave en la respuesta inflamatoria, es obvio especular que la IL-1β, las caspasas inflamatorias y los inflamasomas desempeñan un papel importante en varias enfermedades (como muestra la imagen de la derecha). De hecho, algunas enfermedades hereditarias o adquiridas en humanos se han relacionado con niveles elevados de IL-1β. Varias enfermedades, conocidas como síndromes periódicos asociados a la criopirina (CAPS), se han relacionado directamente con mutaciones en el gen NLRP3. Esta enfermedad autoinflamatoria está caracterizada por producir una inflamación severa de las articulaciones, está asociada con la deposición de cristales de MSU en las articulaciones, entre otras características. Como la MSU es un potente agonista del inflamasoma NLRP3, se cree que la IL-1β regulada por el inflamasoma ejerce un papel patógeno en la gota. Además, la secreción de IL-1β por el inflamasoma NLRP3 se desencadena por un alto nivel de glucosa extracelular en las células b. La IL-1β elevada es un factor de riesgo para el desarrollo de Diabetes Mellitus Tipo 2 (T2DM) y contribuye a la resistencia a la insulina. Esto funciona como un sensor para el estrés metabólico, como en la forma de urato monosódico (MSU) o hiperglucemia, la NLRP3 Es probable que el inflamasoma contribuya a la patogénesis de la gota o la DMT2, respectivamente.

Además, varios reguladores del inflamasoma tienen una relevancia significativa en las enfermedades. En pacientes con FMF (fiebre mediterránea familiar), se demostró que la pirina estaba mutada. Los niveles elevados de IL-1β en la enfermedad autoinflamatoria PAPA (artritis piógena, pioderma gangrenoso y acné) se asocian con mutaciones en PSTPIP1, una proteína que interactúa con la pirina. En conjunto, esto indica la importancia de los reguladores de pirina e inflamasoma en las enfermedades autoinflamatorias y puede permitir nuevos puntos de entrada para el tratamiento de la enfermedad.

Los inflamasomas son complejos de múltiples proteínas implicados en la inflamación fisiológica y patológica. El inmonoblot para caspasa-1 es el método estándar para detectar la activación del inflamasoma, pero esta técnica presenta ciertas dificultades técnicas, en particular con la elección de protocolos de precipitación, separación y transferencia de proteínas. Los pasos de unión y activación también son cruciales para obtener un resultado de inmunoblot exitoso. A continuación se enumeran los Protocolos de Springer de la Serie de Métodos y Protocolos que utilizan los Anticuerpos Estándar que Adipogen para la detección de Inflammasomas.

No existe una sola enfermedad que no tenga un componente inflamatorio y con el riesgo de “Que se haga crónica”

Lee ANTICUERPOS POLICLONALES VS MONOCLONALES
Los anticuerpos, también conocidos como inmunoglobulinas, son secretados por los linfocitos B para neutralizar antígenos de bacterias y virus. La representación clásica de un anticuerpo es una molécula en forma de Y compuesta por cuatro polipéptidos: dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Cada punta de la “Y” contiene un parátopo (una estructura análoga a una cerradura) que es específica para un epítope particular (similarmente este análogo sería una llave) en un antígeno, lo que permite que estas dos estructuras se unan con precisión. La capacidad de unirse a un antígeno ha llevado a un uso habitual en una variedad de experimentos en el ámbito de las ciencias de la vida y la biomedicina. Estos anticuerpos se pueden clasificar en dos tipos de anticuerpo primario: los monoclonal y los policlonales. Cada uno de ellos tiene un papel importante en el sistema inmunológico, en las pruebas diagnósticas y en los tratamientos.
ANTICUERPOS POLICLONALES Y MONOCLONALES: DIFERENCIAS EN LA PRODUCCIÓN

The process to generate the polyclonal antibody
Los anticuerpos policlonales (pAbs) son una mezcla heterogénea de anticuerpos que generalmente son producidos por diferentes clones de células B en el cuerpo. Pueden reconocer y unirse a muchos epítopos diferentes de un solo antígeno.
Los anticuerpos policlonales se producen inyectando un inmunógeno en un animal. Después de ser inyectado con el antígeno específico para provocar una respuesta inmune primaria, al animal se le administra una segunda inmunización, e incluso una tercera… con el fin de producir títulos más altos de anticuerpos contra el antígeno en concreto. Después de la inmunización, los anticuerpos policlonales pueden obtenerse directamente del suero o purificarse para obtener una solución que esté libre de otras proteínas séricas.
Los anticuerpos monoclonales (mAbs) son generados por células B idénticas que son clones de una sola célula madre. Esto significa que los anticuerpos monoclonales tienen afinidad monovalente y solo reconocen el mismo epítopo de un antígeno.
A diferencia de los anticuerpos policlonales, que se producen en animales vivos, los anticuerpos monoclonales se producen en modelos ex vivo utilizando cultivo celular. El proceso comienza con una inyección del antígeno deseado en un animal, a menudo un ratón. Una vez que el animal desarrolla una respuesta inmune, los linfocitos B se aíslan del bazo del animal y se fusionan con una línea celular de mieloma, creando hibridomas inmortalizados de células B y mielomas. Los hibridomas, que son capaces de crecer continuamente en cultivo mientras producen anticuerpos, se seleccionan para el anticuerpo monoclonal deseado.

ANTICUERPOS POLICLONALES: PROS Y CONTRAS
Las ventajas y desventajas de los anticuerpos policlonales se deben principalmente a su especificidad multiepítopos. Las principales ventajas y desventajas se enumeran a continuación:
Ventajas:
Su coste es bajo y son relativamente rápidos de producir (+/- 3 meses).
Mayor afinidad contra el antígeno debido al reconocimiento de múltiples epítopos.
Posee una alta sensibilidad para detectar proteínas que se encuentran en cantidades bajas.
Alta capacidad para capturar la proteína diana (se recomienda su uso en el anticuerpo de captura en un ELISA tipo sándwich).
La afinidad del anticuerpo da como resultado una unión más rápida al antígeno objetivo (recomendado para ensayos que requieren la captura rápida de la proteína; por ejemplo, IP o ChIP).
Uso indicado si nuestro objetivo es la detección de una proteína nativa.
Fácil de acoplar con fluoroforos ya que es poco probable que afecte a la capacidad de unión.
Desventajas:
Variabilidad entre lotes (debido a que se producen en diferentes animales y a diferente momento).
Elevada posibilidad de reactividad cruzada debido al reconocimiento de múltiples epítopos (los anticuerpos purificados por afinidad muestran una reactividad cruzada mínima).
ANTICUERPOS MONOCLONALES: PROS Y CONTRAS
Ventajas:
Reproducibilidad lote a lote (alta homogeneidad).
Posibilidad de producir grandes cantidades de anticuerpos idénticos (una ventaja para la fabricación de diagnóstico y el desarrollo terapéutico de fármacos).
Alta especificidad para un solo epítopo reflejado en baja reactividad cruzada.
Más sensible en los ensayos que requieren la cuantificación de los niveles de proteína.
Bajo ruido de fondo.
Desventajas:
Más caro de producir. Es necesario producir un conjunto de varios anticuerpos monoclonales.
Requiere significativamente más tiempo para producir y desarrollar el clon hibridado (+/- 6 meses).
Más susceptible a los cambios de unión cuando está unido a fluorocromo.
CONCLUSIONES
Los anticuerpos policlonales se producen utilizando varias células inmunes diferentes. Tendrán la afinidad por el mismo antígeno pero diferentes epítopos, mientras que los anticuerpos monoclonales se fabrican utilizando células inmunes idénticas que son todos clones de una célula parental específica (Figura 1).

Para aplicaciones como el desarrollo de fármacos terapéuticos que requieren grandes volúmenes de anticuerpos idénticos específicos para un solo epítopo, los anticuerpos monoclonales son una mejor solución. Sin embargo, para aplicaciones de investigación general, las ventajas de los anticuerpos policlonales generalmente superan las pocas ventajas que proporcionan los anticuerpos monoclonales. Con la purificación por afinidad del suero contra dianas de antígenos pequeños, las ventajas de los anticuerpos policlonales se amplían aún más.

Antígeno

ANTÍGENO ANTICUERPO POLICLONALES VS MONOCLONALES

La base de la inmunidad la constituyen la reacción de un antígeno y un anticuerpo

UN ANTÍGENO es una molécula ajena o tóxica para el organismo que, una vez dentro del cuerpo, induce en este una respuesta inmunitaria, provocando la formación de anticuerpos

ANTICUERPO Sustancia segregada por los linfocitos de la sangre para combatir una infección de virus o bacterias que afecta al organismo.
«las vacunas introducen en el organismo antígenos que provocan la creación de los anticuerpos necesarios para inmunizarlo contra una infección determinada»
Anticuerpo monoclonal
Por lo general, los anticuerpos monoclonales son grandes proteínas utilizadas por el sistema inmunitario para identificar y neutralizar objetos extraños, como bacterias, virus, etc.
En el caso concreto de los anticuerpos monoclonales (mAbs) se trata de glicoproteínas producidas por el clon de una célula híbrida (creada a partir de la fusión de una sola célula madre del sistema inmune y una célula plasmática tumoral) y diseñada para atacar a un antígeno concreto. Suele aplicarse al tratamiento de enfermedades como el cáncer o la artritis reumatoide.

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ANTICUERPOS POLICLONALES VS MONOCLONALES
Los anticuerpos, también conocidos como inmunoglobulinas, son secretados por los linfocitos B para neutralizar antígenos de bacterias y virus. La representación clásica de un anticuerpo es una molécula en forma de Y compuesta por cuatro polipéptidos: dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Cada punta de la “Y” contiene un parátopo (una estructura análoga a una cerradura) que es específica para un epítope particular (similarmente este análogo sería una llave) en un antígeno, lo que permite que estas dos estructuras se unan con precisión. La capacidad de unirse a un antígeno ha llevado a un uso habitual en una variedad de experimentos en el ámbito de las ciencias de la vida y la biomedicina. Estos anticuerpos se pueden clasificar en dos tipos de anticuerpo primario: los monoclonal y los policlonales. Cada uno de ellos tiene un papel importante en el sistema inmunológico, en las pruebas diagnósticas y en los tratamientos.
ANTICUERPOS POLICLONALES Y MONOCLONALES: DIFERENCIAS EN LA PRODUCCIÓN

The process to generate the polyclonal antibody
Los anticuerpos policlonales (pAbs) son una mezcla heterogénea de anticuerpos que generalmente son producidos por diferentes clones de células B en el cuerpo. Pueden reconocer y unirse a muchos epítopos diferentes de un solo antígeno.
Los anticuerpos policlonales se producen inyectando un inmunógeno en un animal. Después de ser inyectado con el antígeno específico para provocar una respuesta inmune primaria, al animal se le administra una segunda inmunización, e incluso una tercera… con el fin de producir títulos más altos de anticuerpos contra el antígeno en concreto. Después de la inmunización, los anticuerpos policlonales pueden obtenerse directamente del suero o purificarse para obtener una solución que esté libre de otras proteínas séricas.
Los anticuerpos monoclonales (mAbs) son generados por células B idénticas que son clones de una sola célula madre. Esto significa que los anticuerpos monoclonales tienen afinidad monovalente y solo reconocen el mismo epítopo de un antígeno.
A diferencia de los anticuerpos policlonales, que se producen en animales vivos, los anticuerpos monoclonales se producen en modelos ex vivo utilizando cultivo celular. El proceso comienza con una inyección del antígeno deseado en un animal, a menudo un ratón. Una vez que el animal desarrolla una respuesta inmune, los linfocitos B se aíslan del bazo del animal y se fusionan con una línea celular de mieloma, creando hibridomas inmortalizados de células B y mielomas. Los hibridomas, que son capaces de crecer continuamente en cultivo mientras producen anticuerpos, se seleccionan para el anticuerpo monoclonal deseado.

ANTICUERPOS POLICLONALES: PROS Y CONTRAS
Las ventajas y desventajas de los anticuerpos policlonales se deben principalmente a su especificidad multiepítopos. Las principales ventajas y desventajas se enumeran a continuación:
Ventajas:
Su coste es bajo y son relativamente rápidos de producir (+/- 3 meses).
Mayor afinidad contra el antígeno debido al reconocimiento de múltiples epítopos.
Posee una alta sensibilidad para detectar proteínas que se encuentran en cantidades bajas.
Alta capacidad para capturar la proteína diana (se recomienda su uso en el anticuerpo de captura en un ELISA tipo sándwich).
La afinidad del anticuerpo da como resultado una unión más rápida al antígeno objetivo (recomendado para ensayos que requieren la captura rápida de la proteína; por ejemplo, IP o ChIP).
Uso indicado si nuestro objetivo es la detección de una proteína nativa.
Fácil de acoplar con fluoroforos ya que es poco probable que afecte a la capacidad de unión.
Desventajas:
Variabilidad entre lotes (debido a que se producen en diferentes animales y a diferente momento).
Elevada posibilidad de reactividad cruzada debido al reconocimiento de múltiples epítopos (los anticuerpos purificados por afinidad muestran una reactividad cruzada mínima).
ANTICUERPOS MONOCLONALES: PROS Y CONTRAS
Ventajas:
Reproducibilidad lote a lote (alta homogeneidad).
Posibilidad de producir grandes cantidades de anticuerpos idénticos (una ventaja para la fabricación de diagnóstico y el desarrollo terapéutico de fármacos).
Alta especificidad para un solo epítopo reflejado en baja reactividad cruzada.
Más sensible en los ensayos que requieren la cuantificación de los niveles de proteína.
Bajo ruido de fondo.
Desventajas:
Más caro de producir. Es necesario producir un conjunto de varios anticuerpos monoclonales.
Requiere significativamente más tiempo para producir y desarrollar el clon hibridado (+/- 6 meses).
Más susceptible a los cambios de unión cuando está unido a fluorocromo.
CONCLUSIONES
Los anticuerpos policlonales se producen utilizando varias células inmunes diferentes. Tendrán la afinidad por el mismo antígeno pero diferentes epítopos, mientras que los anticuerpos monoclonales se fabrican utilizando células inmunes idénticas que son todos clones de una célula parental específica (Figura 1).

Para aplicaciones como el desarrollo de fármacos terapéuticos que requieren grandes volúmenes de anticuerpos idénticos específicos para un solo epítopo, los anticuerpos monoclonales son una mejor solución. Sin embargo, para aplicaciones de investigación general, las ventajas de los anticuerpos policlonales generalmente superan las pocas ventajas que proporcionan los anticuerpos monoclonales. Con la purificación por afinidad del suero contra dianas de antígenos pequeños, las ventajas de los anticuerpos policlonales se amplían aún más.