ANTICUERPOS CONTRA EL CÁNCER  
ANTICUERPOS CONTRA EL CÁNCER     La inmunoterapia para el cáncer es un resultado directo de los avances en la tecnología para la generación de anticuerpos recombinantes , la ingeniería de la terapia celular y genética y la creciente apreciación del papel del sistema inmunológico en la prevención y el control del cáncer. Se ha implementado con éxito en la clínica para cánceres hematológicos, como la leucemia linfocítica crónica (CLL), el linfoma no Hodgkin (NHL)y leucemia linfocítica aguda (ALL) . Si bien los tumores sólidos han demostrado ser más difíciles de atacar, la inmunoterapia está ganando terreno para el tratamiento en algunos casos. Una vez considerada un tratamiento de último recurso, la inmunoterapia suele ser la primera línea de tratamiento para el melanoma avanzado y metastásico .   Células del sistema inmunológico implicadas en la vigilancia de los tejidos y la inmunosupresión dentro del microambiente tumoral. El sistema inmunológico participa en todas las etapas de la supresión tumoral: Las células asesinas naturales (NK) , las células T γδ y las células T CD8 citotóxicas promueven la apoptosis de las células tumorales. Las células dendríticas (DCs) prime CD4 y CD8 células T contra antígenos asociados a tumores (TAA). Los macrófagos fagocitan las células muertas y moribundas y promueven la inflamación . Sin embargo, durante la tumorigénesis y la progresión de la enfermedad, el tumor suprime activamente esta potente respuesta inmunitaria al: Creando un microambiente hipóxico, excluyendo las células T citotóxicas. Secreción de TGF-beta (TGF-β) y adenosina . Promover la formación y el reclutamiento de células inmunosupresoras: células T reguladoras (Tregs) , células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) y macrófagos asociados a tumores (TAM). Regulación ascendente de ligandos inhibidores para prevenir la citotoxicidad mediada por células. En resumen, el sistema inmunológico tiene una potente respuesta antitumoral y el tumor tiene una potente respuesta antiinmunitaria. La inmunoterapia es lo que ayuda a inclinar la balanza a favor de la respuesta inmunitaria antitumoral.   Inmunoterapia mediada por anticuerpos Una de las principales estrategias para estimular la respuesta inmune a los tumores aprovecha la especificidad de los anticuerpos. Según el Instituto de Investigación del Cáncer, hay tres tipos principales de terapias mediadas por anticuerpos: anticuerpos monoclonales (mAb), anticuerpos biespecíficos y conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC). Anticuerpos monoclonicos Ilustración de cómo se puede formar un anticuerpo biespecífico a partir de dos anticuerpos monoclonales. La región variable de dos anticuerpos, uno azul y otro verde, se puede unir para formar un anticuerpo biespecífico de fragmento variable monocatenario. Anticuerpos biespecíficos Ilustración de un anticuerpo monoclonal biespecífico similar a Ig. Descripción Reconoce un antígeno Reconoce dos antígenos Objetivo (antígeno) Marcadores de activación Marcadores inhibidores de las células inmunes Ligandos inhibidores en células tumorales Antígenos asociados a tumores (TAA) Receptor activador en células inmunes y TAA Dos puestos de control inmunes Función Agotamiento de células de leucemia y linfoma (ex Rituximab) Iniciar citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) Bloqueo de puntos de control inmunológico Redirección citotóxica: acerque las células inmunitarias y las células diana para facilitar la opsonización o la muerte celular. Co-bloqueo de puntos de control inmunológico: bloquea simultáneamente dos objetivos de puntos de control inmunitarios Nota: Puede encontrar más información sobre los ADC en el Instituto de Investigación del Cáncer.   Volver a la cima   Bloqueo de puntos de control inmunológico La respuesta inmune está estrictamente regulada por puntos de control, logrando un cuidadoso equilibrio entre los receptores inhibidores y de activación. Los receptores inhibidores de las células inmunitarias son fundamentales para evitar daños innecesarios al huésped. Las células innatas , como las células NK y las células T γδ, expresan de forma constitutiva receptores inhibidores para evitar la muerte y fagocitosis de las células hospedadoras sanas, mientras que las células T α / β regulan positivamente los receptores inhibidores poco después de la activación para regular la expansión y la función efectora. Las células tumorales, como las del cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), el cáncer de próstata y el melanoma, regularán positivamente los ligandos inhibidores para evitar la destrucción por parte del sistema inmunológico.     En general, la terapia de bloqueo de puntos de control inmunológico busca interrumpir la interacción receptor-ligando entre el receptor inhibidor de las células inmunes y el ligando expresado en las células tumorales. La terapia de bloqueo de puntos de control libera a las células inmunitarias de esta inhibición. La caracterización ex vivo o in vitro de los puntos de control inmunitarios es el primer paso hacia el desarrollo de una inmunoterapia eficaz. Además de la citometría de flujo , la inmunohistoquímica (IHC) y la inmunocitoquímica / inmunofluorescencia (ICC / IF) , Bio-Techne tiene una gran selección de anticuerpos de puntos de control inmunitarios altamente validados para el bloqueo y la neutralización.   Tres gráficos que muestran la dosis-respuesta del bloqueo de anticuerpos anti-receptor para Anti-Human PD-1, Anti-Cynomolgus TIGIT y Anti-Mouse CD47. Datos de ELISA funcional que muestran un bloqueo exitoso de la interacción receptor-ligando con el anticuerpo bloqueador del receptor. La línea naranja muestra que el ligando recombinante se une al receptor de manera dependiente de la dosis, en ausencia del anticuerpo. (Izquierda) A 0.09-0.72 µg / mL, Mouse Anti-Human PD-1 (1015846) (Catálogo # MAB10864 ) bloqueará el 50% de la unión de 5 µg / mL de recombinante humano PD-L1 / B7-H1 Fc Chimera (línea naranja, catálogo nº 156-B7 ) a la proteína recombinante humana PD1 etiquetada con His inmovilizada (nº de catálogo 8986-PD ) recubierta a 1 µg / ml (100 µl / pocillo). A 5 µg / mL, este anticuerpo bloqueará> 90% de la unión. (Medio) A 70-350 ng / mL, conejo Anti-Cynomolgus TIGIT(2629A) (catálogo n.o MAB10532 ) bloqueará el 50% de la unión de TIGIT de mono Cynomolgus recombinante ( n.o de catálogo 9380-TG ) unido a CD155 / PVR humano recombinante inmovilizado ( n.o de catálogo 2530-CD ) recubierto a 2,5 µg / ml (100 µL / pocillo). (derecha) A 0.08-0.8 µg / mL, Rat Anti-Mouse CD47 (974222) (Catálogo # MAB18661 ) bloqueará el 50% de la unión de 0.25 µg / mL de Recombinant Mouse CD47 Fc Chimera (línea naranja, Catálogo # 1866- CD ) al ratón recombinante inmovilizado SIRP alpha / CD172a Fc Chimera ( n.o de catálogo 7154-SA) recubierto a 1 µg / mL (100 µL / pocillo). A 5 µg / mL, este anticuerpo bloqueará> 90% de la unión.   Objetivos actuales y emergentes para el bloqueo de puntos de control inmunológico Las dos primeras terapias de bloqueo de puntos de control inmunitarios aprobadas para su uso en humanos se dirigen a los ejes CTLA-4 / CD80 – CD86 y PD-1 / PD-L1 , ambos miembros de las familias de puntos de control inmunitarios B7-CD28. Las proteínas de la familia B7 se expresan en la superficie de las células presentadoras de antígenos (APC) y las células tumorales e interactúan con los receptores de la familia de proteínas CD28 en las células inmunitarias. Los miembros de estas familias son necesarios para las funciones coestimuladoras y co-inhibidoras de las células T. Se están investigando muchos otros miembros de las familias de proteínas B7-CD28 como dianas adicionales para la inmunoterapia. Imagen ICC / IF que muestra la expresión de PD-L1 (verde) y contrateñida con DAPI (azul) en la línea celular de glioblastoma U-251. PD-L1 es un objetivo clínico para el bloqueo de puntos de control inmunológico. Anticuerpo anti-PD-L1 altamente validado con reactividad cruzada en tejidos humanos, de ratón y de rata. ICC / IF de la línea celular U-251 de glioblastoma maligno. Las células se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 10 minutos y se permeabilizaron en Triton X-100 al 0,05% en PBS durante 5 minutos. Las células se incubaron con Rabbit Anti-Human / Mouse / Rat PD-L1 (Catálogo # NBP1-76769 ) a 1 ug / ml durante la noche a 4C y se detectaron con un anti-conejo DyLight 488 (Green) a una dilución 1: 1000 para 60 minutos. Los núcleos se contratiñeron con DAPI (azul). Se tomaron imágenes de las células usando un objetivo de 100X y se desconvolucionaron digitalmente. NBP1-76769 ha sido validado por tres de los cinco pilares de la validación de anticuerpos , que incluyenEstrategias genéticas, estrategias de anticuerpos independientes y estrategias biológicas .   B7 Puntos de control de inmunidad familiar Receptor: en células inmunes Ligando: en la célula tumoral PD-1 PD-L1 , PD-L2 CTLA-4 CD80 , CD86 Receptor desconocido B7-H3 / CD276 Receptor desconocido B7-H4 PSGL-1 , receptor alternativo desconocido VISTA / B7-H5 VISTA / B7-H5 VSIG-3 KIR3DL3 B7-H7 / HHLA2   Gráfico de citometría de flujo de histograma que muestra el bloqueo eficaz de la unión de la proteína con el anticuerpo HHLA2 en una histografía rellena de naranja. La línea de puntos negra muestra la expresión de proteína sin anticuerpo y la línea azul muestra la expresión de proteína con anticuerpo de control de isotipo. Bloqueo / neutralización de HHLA-2 en un ensayo de citometría de flujo funcional. Brevemente, la línea celular de riñón embrionario humano HEK293 se transfectó con B7-H7 / HHLA-2 humano y se tiñó con TMIGD2 / CD28H humano recombinante biotinilado (10 ng / ml, catálogo n. ° 8316-TR ), seguido de estreptavidina-APC (catálogo n. ° F0050 -NOV ) (negro, línea de puntos). La unión está completamente bloqueada (histograma naranja) por 2,5 μg / mL de Mouse Anti-Human B7-H7 / HHLA2 (907812) (Catálogo # MAB80841 ). Se usó como control el control de isotipo IgG1 de ratón (nº de catálogo MAB002 ) a 2,5 μg / ml (línea azul).   Un estudio de 2018 encontró que solo alrededor del 43% de los pacientes con cáncer son elegibles para la terapia de bloqueo de puntos de control, y la frecuencia de los pacientes que responden es de alrededor del 12%. Debido a que un porcentaje tan pequeño de pacientes responde al bloqueo de puntos de control actual, los puntos de control adicionales, más allá de la familia B7, son de gran interés, incluidos otros inhibidores de la citotoxicidad, como TIM-3 y TIGIT . Las células tumorales también pueden regular al alza los ligandos para inhibir la fagocitosis patrullando los macrófagos y las células mieloides. Estos ligandos, como CD24 y CD47 , se expresan en todas las células de mamíferos y son una señal de «no me comas» para el sistema inmunológico innato.   Imagen de inmunohistoquímica y tinción de hibridación in situ de ARN del marcador inhibidor   Validación de Estrategias Ortogonales. TIM-3 es un receptor inhibidor expresado en la superficie de las células T y las células NK. El ARNm de TIM-3 se detectó en secciones de tejido de amígdala humana incluidas en parafina fijadas con formalina sondas con ACD RNAScope® Probe HAVCR2 (ACD Catalog # 560681) y teñidas con ACD RNAScope® 2.5 HD Detection Reagents-Red (imagen derecha, ACD Catalog # 32260). La sección de tejido adyacente se procesó para inmunohistoquímica utilizando Anticuerpo TIM-3 antihumano de cabra (R&D Systems Catalog # AF2365 ) seguido de incubación con Anticuerpo de polímero VisUCyte HRP de IgG anti-cabra (R&D Systems, Catálogo # VC004 ) y cromógeno DAB (imagen derecha , amarillo marron). Los tejidos se tiñeron por contraste con hematoxilina (azul).   Receptor: en células inmunes Ligando: en la célula tumoral Inhibición de la citotoxicidad LAG-3 MHC-II , Galectin-3 , LSECtin / CLEC4G , FGL-1 TIGIT CD155 (PVR) , CD112 (PVRL2) TIM-3 Galectina-9 , HMGB-1 ILT2 HLA-G NKG2A HLA-E Inhibición de la fagocitosis Siglec-10 CD24 SIRP-alfa CD47 Obtenga más información sobre objetivos de puntos de control inmunológicos con el libro electrónico de Bio-Techne, Objetivos de puntos de control inmunológicos actuales y emergentes para la investigación en inmuno-oncología .   Gráfico de histograma de citometría de flujo que muestra la expresión de HLA-G en queratinocitos humanos. La expresión de HLA-G contribuye a la función inmunomoduladora de los queratinocitos humanos. Expresión de superficie de HLA-G determinada por citometría de flujo de queratinocitos humanos teñidos con Alexa Fluor 700 conjugado de ratón anti-HLA-G humano (87G) (número de catálogo NBP1-43123AF700 ) (histograma rojo) o control de isotipo (histograma azul). Imagen adaptada de Mestrallet G, Auvré F, Schenowitz C, Carosella ED, LeMaoult J, Martin MT, Rouas-Freiss N, Fortunel NO. Los queratinocitos humanos inhiben la proliferación de células T CD4 + a través de la secreción de TGFB1 y la expresión superficial de los puntos de control inmunológico HLA-G1 y PD-L1 . Células. 8 de junio de 2021; 10 (6): 1438. doi: 10.3390 / cells10061438. PMID: 34201301; PMCID: PMC8227977. Licencia proporcionada por CC-BY .   La eficacia del bloqueo de los puntos de control inmunitarios está determinada por varios factores: la expresión de receptores inhibidores por parte de los tumores, la penetración de anticuerpos terapéuticos en los tumores sólidos y la accesibilidad del tumor a las células inmunitarias. Debido a la redundancia de la expresión del inhibidor (por ejemplo, tanto LAG-3 como PD-1 expresados ​​en la misma célula) y la complejidad del microambiente tumoral (TME), podría ser necesario un bloqueo de puntos de control inmunitario combinado para lograr una inmunidad antitumoral óptima. El bloqueo combinado de puntos de control podría incluir dos o más receptores co-inhibidores o un enfoque de múltiples frentes dirigido a un receptor inhibidor y un inhibidor de la fagocitosis, como CD47 . El bloqueo combinado se puede lograr con un cóctel de anticuerpos monoclonales o un anticuerpo biespecífico diseñado.   Gráfico de pseudocolor de citometría de flujo que muestra la población de células LAG-3 + en células T activadas Receptor inhibidor de LAG-3 expresado en la superficie de células T estimuladas. Las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) no se trataron (panel inferior) o se trataron con 5 μg / ml de PHA (panel superior). Las PBMC se tiñeron con Mouse Anti-Human LAG-3 (1009611) (Catálogo # MAB23195 ) seguido de Anticuerpo secundario anti-IgG de ratón conjugado con Alophycocyanin (APC) (Catálogo # F0101B ) y Anti-Human CD3 epsilon de ratón conjugado con PE (UCHT1) ) (Catálogo # FAB100P ). Los marcadores de cuadrante se establecieron basándose en la tinción del anticuerpo de control de isotipo (catálogo nº MAB003 ). HCDM utilizó el clon UCHT1 de CD3 en el taller de HLDA para establecer la designación de CD.       Los avances en la ingeniería de anticuerpos han llevado al desarrollo de anticuerpos biespecíficos. Como lo indica su nombre, las regiones variables de estos anticuerpos reconocen dos antígenos diferentes.                                                   Estructura   Ig-como Ilustración de un anticuerpo monoclonal biespecífico similar a Ig. F (ab) 2 Ilustración del anticuerpo monoclonal biespecífico F (ab). ScFv Ilustración del anticuerpo monoclonal biespecífico scFv. Cadena pesada completa (Hc) y cadena ligera (Lc) de dos anticuerpos monoclonales Fragmentos de unión a antígeno de longitud completa (F (ab)) de dos anticuerpos monoclonales, ligados químicamente Fragmentos variables de cadena única (scFv) de la cadena pesada y ligera de dos anticuerpos monoclonales Función Se une a dos antígenos y la región constante (Fc) puede activar receptores Fc (FcR) en DC, macrófagos y células NK Bifuncional: une dos antígenos sin dominio Fc funcional Bifuncional: une dos antígenos sin dominio Fc funcional Ventajas Puede activar FcR para una funcionalidad adicional: ADCC Fagocitosis Talla pequeña Baja inmunogenicidad Agregar funcionalidad en las regiones del vinculador Talla pequeña Baja inmunogenicidad Puede diseñarse fácilmente para ser tri-específico Agregar funcionalidad en las regiones del vinculador El azul y el verde representan dos especificidades antigénicas diferentes. Sólo se muestra un ejemplo de estructuras de fragmentos F (ab) 2 y ScFv.   Para la terapia del cáncer, los anticuerpos biespecíficos se utilizan de dos formas: Bloqueo simultáneo de dos controles inmunes. Redirección de células citotóxicas para interactuar con la célula tumoral.   Enfoque: redirección de células citotóxicas Un anticuerpo biespecífico acerca una célula T a la célula cancerosa. Los anticuerpos biespecíficos para redirigir las células citotóxicas son de gran interés para la inmunoterapia del cáncer. El objetivo principal de este tipo de inmunoterapia es acercar la célula citotóxica, ya sea célula T o célula NK, a la célula tumoral para facilitar su destrucción. Idealmente, el anticuerpo biespecífico está diseñado para activar la célula citotóxica a través de CD3 para las células T y CD16 para las células NK y unirse a un TAA expresado de forma única.   Antígeno asociado a tumor (TAA) Tipo de cáncer Antígeno carcinoembrionario (CEA) Cáncer colonrectal CD33 / Siglec-3 Leucemia mieloide aguda (AML), linfomas EGFR Cáncer de mama, cáncer de páncreas HER2 / ERBB2 Cáncer de mama, cáncer de próstata EpCAM Cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de endometrio, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de próstata MUC1 Cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata Receptor de prolactina (PRLR) Cáncer de mama VEGFR1 Cáncer de mama   Imagen de inmunohistoquímica de tejido de carcinoma de mama que muestra tinción de VEGFR1 en marrón y contratinción con hematoxilina en azul. La expresión de VEGFR1 / Flt-1 se limita a las células cancerosas y no se expresa en las células del estroma tumoral. Análisis IHC-Parafina (IHC-P) de una sección de tejido de carcinoma de mama humano embebido en parafina (FFPE) fijada con formalina usando una dilución 1: 500 de Anticuerpo Policlonal Anti-VEGFR1 / Flt-1 de Conejo (Catálogo # NB100-527 ). El ensayo implicó 20 minutos de recuperación de antígeno inducida por calor (HIER) con tampón de citrato de sodio 10 mM (pH 6,0) y extinción de peroxidasa endógena usando bloque de peróxido. Se utilizó un sistema de detección refinado con polímero y DAB para la detección de la señal que siguió a la contratinción con hematoxilina. La tinción se realizó con Histowiz .   A menudo, los TAA dirigidos por la terapia con anticuerpos no son exclusivos de las células tumorales y también se expresan en células sanas. Sin embargo, los TAA se sobreexpresan con frecuencia en las células tumorales en comparación con las células sanas, lo que brinda la oportunidad de aprovechar la tecnología avanzada de ingeniería de anticuerpos. Para limitar la redirección de células citotóxicas a células sanas no malignas, los anticuerpos biespecíficos proporcionan una clara ventaja sobre las terapias de anticuerpos tradicionales debido a una técnica de ingeniería a la que a menudo se hace referencia como ajuste de afinidad. El ajuste de afinidad implica la selección de anticuerpos con ciertas propiedades de unión, o afinidad, por un antígeno particular. Durante una respuesta inmune in vivo, los anticuerpos a menudo se someten a un proceso llamado maduración por afinidad en el que se seleccionan anticuerpos de alta afinidad en la reacción del centro germinal. Un enfoque de ajuste de afinidad permite la selección de anticuerpos biespecíficos con unión de anticuerpo débil (baja afinidad) al receptor de activación (CD3 o CD16) y unión fuerte (alta afinidad) a TAA, como EpCAM. Esto aumenta la probabilidad de que el anticuerpo se una a una célula tumoral antes de que active la célula citotóxica, mejorando la eficacia y reduciendo la activación no específica.   Inmunocitoquímica de la expresión de EpCAM en la línea celular de cáncer de ovario. Expresión de EpCAM en verde, filamentos de actina teñidos de rojo y DAPI en azul. Los anticuerpos Bio-Techne están validados para una variedad de aplicaciones, incluido ICC / IF. Análisis inmunofluorescente confocal de la línea celular de cáncer de ovario SK-OV-3 usando EpCAM antihumano de ratón conjugado con Alexa Fluor 488 (EGP40 / 826) (catálogo nº NBP2-44643 ) (verde). Los filamentos de actina F se marcaron con DyLight 554 Phalloidin (rojo). Se usó DAPI para teñir los núcleos celulares (azul). Como desafío adicional, los anticuerpos dirigidos contra CD3 se dirigirán indiscriminadamente tanto a las células T citotóxicas CD8 + como a las células reguladoras T CD4 +, lo que podría promover una TME inmunosupresora. Aunque las terapias actualmente aprobadas se dirigen a CD3 y TAA, los investigadores también están explorando anticuerpos biespecíficos dirigidos a marcadores de células NK, como CD16A .   Gráfico de citometría de flujo de pseudocolor que muestra la expresión de CD16 y CD14 en PBMC humanas. CD16 y CD14 generalmente no se expresan en las mismas células. CD16 se expresa en la superficie de las células NK humanas. Se tiñeron células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) con Fc gamma RIII / CD16 antihumano de ratón conjugado con PE (245536) (nº de catálogo FAB2546P ) y CD14 antihumano de ratón conjugado con APC (134620) (nº de catálogo FAB3832A ). Los marcadores de cuadrante se establecieron basándose en la tinción del anticuerpo de control de isotipo (nº de catálogo IC003P ).     Limitaciones y direcciones futuras de la inmunoterapia basada en anticuerpos Con la implementación de terapias basadas en anticuerpos, ha habido avances significativos en el tratamiento del cáncer de neoplasias malignas de alta mortalidad, como NSCLC metastásico y melanoma. Sin embargo, todavía existen limitaciones significativas de la inmunoterapia mediada por anticuerpos, que incluyen: Penetración limitada en tumores sólidos. Los anticuerpos de tipo Ig con dominios Fc pueden ser inmunogénicos. El bloqueo de puntos de control solo es eficaz para tumores «calientes» con actividad inmunitaria y expresión de ligandos inhibidores. Nanoanticuerpos ® con anticuerpos VHH de dominio único, como de Bio-Techne LlaMABodies TM , pueden dirigirse a epítopos de difícil acceso, y pueden tener un papel en inmunoterapias futuras.     REFERENCIAS Moore GL, Lee SH, Schubbert S, Miranda Y, Rashid R, Pong E, et al. El ajuste de la afinidad de las células T mejora la eficacia y la seguridad de los anticuerpos biespecíficos anti-CD38 × anti-CD3 en monos, una terapia potencial para el mieloma múltiple. Blood 2015; 126 : 1798-1798. https://doi.org/10.1182/BLOOD.V126.23.1798.1798 . Wang W, Guo H, Geng J, Zheng X, Wei H, Sun R, et al. La galectina-3 liberada por el tumor, un ligando inhibidor soluble de la NKp30 humana, desempeña un papel importante en el escape del tumor del ataque de las células NK. J Biol Chem 2014; 289 : 33311. https://doi.org/10.1074/JBC.M114.603464 . 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